I.                           PENDAHULUAN
1.1    Latar Belakang
Kultur jaringan adalah teknik pengisolasian bagian tanaman seperti organ jaringan sel dan produksi yang selanjutnya ditumbuhkan dalam media buatan secara aseptik sehingga bagian tersebut beregenerasi menjadi tanaman lengkap. Pelaksanaan teknik kultur jaringan ini berdasarkan teori sel seperti yang ditemukan oleh scheiden dan schwann, yaitu bahwa sel mempunyai kemampuan autonom, bahkan mempunyai kemampuan totipotensi. Totipotesi adalah kemampuan setiap sel, dari mana saja sel tersebut diambil, apabila diletakan dalam lingkungan yang sesuai akan dapat tumbuh menjadi tanaman yang sempurna (Hendaryono & Wijayani 1994).
Faktor-faktor yang perlu diperhatikan untuk keberhasilan kultur jaringan yaitu bahan sterilisasinya, kandungan unsur kimia dalam media, hormon yang digunakan, substansi organik yang ditambahkan dan terang atau gelapnya saat inkubasi. Dari sekian banyak permasalahan, yang harus diteliti dan diperhatikan adalah sterilisasi eksplan yang ingin dikulturkan, karena sangat besar pengaruhnya terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan serta bibit yang dihasilkannya (Daisy 1994).
1.2  Tujuan
Tujuan pelaksanaan praktikum ini antara lain :
  1. Mahasiswa dapat melihat dan membandingkan proses inisiasi dan inokulasi pada berbagai jenis eksplan.
  2. Mahasiswa juga dapat mengetahui pentingnya jenis media yang digunakan pada berbagai jenis eksplan.
II.                        TEORI
Pertumbuhan dan morfogenesis dalam kultur jaringan sangat dipengaruhi oleh keadaan jaringan tanaman yang digunakan sebagai eksplan. Selain faktor genetis eksplan yang telah disebutkan di atas, kondisi eksplan yang mempengaruhi keberhasilan kultur adalah jenis eksplan, ukuran, umur dan fase fisiologis jaringan yang digunakan sebagai eksplan. Meskipun masing-masing sel tanaman memiliki kemampuan totipotensi, namun masing-masing jaringan memiliki kemampuan yang berbeda-beda untuk tumbuh dan beregenerasi dalam kultur jaringan. Oleh karena itu, jenis eksplan yang digunakan untuk masing-masing kultur berbeda-beda tergantung tujuan pengkulturannya.
Umur eksplan sangat berpengaruh terhadap kemampuan eksplan tersebut untuk tumbuh dan beregenerasi. Umumnya eksplan yang berasal dari jaringan tanaman yang masih muda (juvenil) lebih mudah tumbuh dan beregenerasi dibandingkan dengan jaringan yang telah terdiferensiasi lanjut. Jaringan muda umumnya memiliki sel-sel yang aktif membelah dengan dinding sel yang belum kompleks sehingga lebih mudah dimodifikasi dalam kultur dibandingkan jaringan tua. Oleh karena itu, inisiasi kultur biasanya dilakukan dengan menggunakan pucuk-pucuk muda, kuncup-kuncup muda, hipokotil, inflorescence yang belum dewasa, dll. Jika eksplan diambil dari tanaman dewasa, rejuvenilisasi tanaman induk melalui pemangkasan atau pemupukan dapat membantu untuk memperoleh eksplan muda agar kultur lebih berhasil.
Ukuran eksplan juga mempengaruhi keberhasilan kultur. Eksplan dengan ukuran kecil lebih mudah disterilisasi dan tidak membutuhkan ruang serta media yang banyak, namun kemampuannya untuk beregenerasi juga lebih kecil sehingga dibutuhkan media yang lebih kompleks untuk pertumbuhan dan regenerasinya. Sebaliknya semakin besar eksplan, maka semakin besar kemungkinannya untuk membawa penyakit dan makin sulit untuk diterilkan, membutuhkan ruang dan media kultur yang lebih banyak. Ukuran eskplan yang sesuai sangat tergantung dari jenis tanaman yang dikulturkan, teknik dan tujuan pengkulturannya.


Tahap awal ini amat sangat penting dan menentukan bagi keberhasilan mikropropagasi. Keberhasilan tahap ini pertama kali terlihat dari keberhasilan penanaman eksplan pada kondisi aseptis (bebas dari segala kontaminan) dan harus diikuti dengan pertumbuhan awal eksplan sesuai tujuan penanamannya (misalnya: perpanjangan pucuk, pertumbuhan awal tunas, atau pertumbuhan kalus pada eksplan). Setelah 1 – 2 minggu inkubasi, kultur yang terkontaminasi oleh bakteri atau jamur (baik pada media maupun eksplannya) dibuang. Tahap ini selesai dan kultur bisa dipindahkan ke tahap berikutnya bila eksplan yang tidak terkontaminasi telah tumbuh sesuai dengan harapan (misalnya tunas lateral atau tunas adventif tumbuh). Untuk eksplan yang mengalami kontaminasi berat atau yang sulit untuk disterilisasi maka eksplan terlebih dahulu dapat ditanam pada media inkubasi atau establishment yaitu media yang hanya mengandung gula dan agar saja dengan tujuan untuk isolasi eskplan yang tidak terkontaminasi sebelum diinisiasi pada tahap 1 mikropropagasi.
Tujuan dari tahap ini adalah memproduksi kultur axenic. Untuk kebanyakan pekerjaan mikropropagasi, eksplan yang dipilih adalah tunas aksilar atau terminal; hanya pada tanaman terbatas eksplan yang digunakan dapat dari potongan daun seperti pada Begonia dan Saintpaulia (African violet) atau perbungaan pada tanaman Gerbera spp. Faktor-faktor yang berpengaruh pada keberhasilan pada tahap ini adalah:
• Umur tanaman induk
• Umur fisiologis dari eksplan
• Tahap perkembangan dari eksplan
• Ukuran dari eksplan.
Reaksi hipersensitif:
Ketika jaringan tanaman diekspos pada situasi stress seperti luka mekanikal, metabolisme fenolik komplek tersimulasi. Intervensi ini menyebabkan reaksi hipersensitif, seperti:
• Melepaskan isi sel-sel yang rusak.
       Reaksi-reaksi di dalam sel-sel tetangganya tetapi tanpa menunjukkan gejala adanya luka itu sendiri.
       Dan / atau mati premature dari sel-sel yang spesifik dalan lingkungan luka atau tempat infeksi.
Pada umumnya metabolisme fenolik komplek mempunyai 3 tipe reaksi dalam merespon stress atau luka, yakni:
       Oksidasi dari terbentuknya fenolik komplek (mumculnya senyawa quinon dan material polymerisasi).
       Pembentukan turunan monomerik.
       Pembentukan turunan polimer fenolik.
Pembentukan monomer fenolik di dalam jaringan dapat memacu untuk mengakumulasi sejumlah besar produk, atau munculnya produk baru yang berperan dalam mekanisme proteksi dari jaringan yang luka. Peranan dari pruduk ini dapat membentuk pembatas fisik melawan invasi (seperti lignin), atau senyawa inhibitor dari pertumbuhan mikrobia (seperti quinon atau fitoalexin).

III.           METODE PELAKSANAAN
3.1    Waktu dan Tempat
Praktikum dilakukan pada tanggal 20, 27 Januari 2012 dan 3 Februari 2012 di Laboratorium Kultur Jaringan Politeknik Negeri Lampung.
3.2    Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam praktikum ini antara lain pinset panjang, gelas piala, baskom plastik, nampan, dan lampu bunsen, petridis, dan LAFC.
Bahan yang digunakan dalam praktikum ini antara lain alkohol, eksplan daun kopi, biji jeruk dan tunas kopi, serta media MS dan growmore.

3.3    Prosedur Kerja
1.      Eksplan Daun Kopi
  • ·           Ambil pisau dan pinset bakar dengan lampu spritus dan letakan pada cawan petri hingga terbakar diamkan sampai padam.
  • ·           Ambil eksplan yang telah diseterilisasi dengan menggunakan pinset dan pisau yang telah disterilisasi. Letakan eksplan pada cawan petri yang telah diolesi dengan alcohol dan lakukan pemotongan dengan hati-hati. Eksplan diambil dari dua ruas tulang daun, yang dipotong berbentuk persegi dengan ukuran ± 1 cm.
  • ·           Buka penutup botol kultur dan arahkan botol kelampu Bunsen, tetapi membelakangi blower agar kotoran tidak masuk kedalam botol kultur, begitu pula dengan penutupnya dipanaskan diatas lampu Bunsen.
  • ·           Masukan eksplan yang telah dipotong ke dalam media tanam kemudian tutup botol kultur sekencang mungkin agar sumber kontaminan tidak masuk.
  • ·           Beri label yang berisi nama, tanggal penanaman untuk mempermudahkan dalam pengamatan, kemudian letakan botol kedalam ruang pertumbuhan.
2.             Penanaman Tunas Kopi
  • ·         Ambil pisau dan pinset bakar dengan lampu spritus dan letakan pada cawan petri hingga terbakar diamkan sampai padam.
  • ·         Ambil eksplan yang telah diseterilisasi dengan menggunakan pinset dan pisau yang telah disterilisasi. Letakan eksplan pada cawan petri yang telah diolesi dengan alcohol dan lakukan pemotongan dengan hati-hati. Eksplan yang dipakai adalah dari mata tunas yang dipotong hingga hanya ada tunas dan sedikit batang. 
  • ·         Buka penutup botol kultur dan arahkan botol kekelamp Bunsen, tetapi membelakangi blower agar kotoran tidak masuk kedalam botol kultur, begitu pula dengan penutupnya dipanaskan diatas lampu Bunsen.
  • ·         Ambil eksplan yang telah dipotong tadi lalu dimasukan kedalam media tanam dengan posisi berdiri. Tutup botol kultur sekencang mungkin agar sumber kontaminan tidak masuk.
  • ·          Beri label yang berisi nama, tanggal penanaman untuk mempermudahkan dalam pengamatan. Kemudian letakan botol kedalam ruang pertumbuhan.
3.             Penanaman Biji Jeruk
  • ·         Ambil pisau dan pinset bakar dengan lampu spritus dan letakan pada cawan petri hingga terbakar diamkan sampai padam.
  • ·         Ambil eksplan yang telah diseterilisasi dengan menggunakan pinset dan pisau yang telah disterilisasi. Letakan eksplan pada cawan petri yang telah diolesi dengan alcohol dan lakukan pemotongan dengan hati-hati. Eksplan yang adalah mata tumbuh pada biji jeruk.
  • ·         Buka penutup botol kultur dan arahkan botol kelampu Bunsen, tetapi membelakangi blower agar kotoran tidak masuk kedalam botol kultur, begitu pula dengan penutupnya dipanaskan diatas lampu Bunsen.
  • ·         Masukan eksplan yang telah dipotong ke dalam media tanam kemudian tutup botol kultur sekencang mungkin agar sumber kontaminan tidak masuk.
  • ·         Beri label yang berisi nama, tanggal penanaman untuk mempermudahkan dalam pengamatan. Kemudian letakan botol kedalam ruang pertumbuhan.

IV.                    HASIL DAN PEMBAHASAN
Jenis explan
Jenis media
Minggu
ke1
Minggu ke2
Minggu ke3
Minggu ke4
Daun Kopi
Growmore
MS
––
––



Tunas Kopi
MS
Gandasil
++
+–
+–
+–
+–
––
––
Biji Jeruk
MS
+–
+
––

Aklimtisasi anggrek yang hidup 100%
Keterangan :
  • ++ =  Hidup tidak terkontaminasi
  • + =  Hidup terkontaminasi
  • –– =  Tidak tumbuh/mati

Dari hasil pengamatan selama 7 minggu dapat dilihat perkembangan eksplan yang telah di tanam  di ruang pertumbuhan. Pada minggu pertama pengamatan eksplan daun kopi terlihat tidak dapat tumbuh dan terkontaminan oleh jamur. Sedangkan minggu kedua tunas kopi dapat tumbuh akan tetapi pada minggu ke-2 terlihat eksplan tunas kopi juga mengalami kontaminasi walaupun eksplan tunas kopi sudah mulai tumbuh. Terlihat pada botol kultur dipenuhi dengan jamur putih hal ini terjadi karena botol eksplan yang sudah terkontaminasi oleh jamur tidak cepat dipisahkan. Sehingga botol eksplan yang masih steril tertular dan terkontaminasi. Pada eksplan biji jeruk dapat tumbuh namun terkontaminasi oleh jamur.
Sumber kontaminasi kultur adalah eksplan, disamping komponen media, faktor manusia dan lingkungan. Karena itu, eksplan harus dibersihkan dari kotoran terluar dan disterilisasi. Sterilisasi eksplan hanya sebatas sterilisasi permukaan atau disinfestasi (menghilangkan infestasi kontaminan), bukan disinfeksi (menghilangkan infeksi kontaminan dalam eksplan). Dalam proses sterilisasi eksplan, yang dibersihkan adalah debu, cendawan dan bakteri, atau kontaminan dari bagian permukan eksplan, bukan yang berada di bagian dalam eksplan.
Proses sterilisasi eksplan harus disesuaikan dengan jenis eksplan, tingkat kelunakan jaringan dan kandungan kontaminan pada eksplan yang digunakan. Satu hal yang penting dalam sterilisasipermukaan eksplan adalah mengompromikan antara usaha untuk mendapatkan eksplan yang steril dan menjga agar jaringan eksplan tidak rusak akibat tingginya kosentrasi disinfektan. Karena itu, selain pengetahuan dasar tentang bagian tanaman yang digunakan sebagai eksplan dan cara sterilisasinya, diperlukan juga the art of propagation (seni memperbanyak tanaman).

V.                KESIMPULAN
5.1    Kesimpulan
Proses sterilisasi eksplan harus disesuaikan dengan jenis eksplan, tingkat kelunakan jaringan dan kandungan kontaminan pada eksplan yang digunakan. Satu hal yang penting dalam sterilisasipermukaan eksplan adalah mengompromikan antara usaha untuk mendapatkan eksplan yang steril dan menjga agar jaringan eksplan tidak rusak akibat tingginya kosentrasi disinfektan. Karena itu, selain pengetahuan dasar tentang bagian tanaman yang digunakan sebagai eksplan dan cara sterilisasinya, diperlukan juga the art of propagation (seni memperbanyak tanaman).
Untuk meminimalkan tingkat kontaminasi dan mendapatkan pertumbuhan eksplan yang cepat, beberapa perlakukan terhadap tanaman induk sumber eksplan dapat diterapkan. Pemeliharaan tanaman induk dalam keadaan yang lebih higienis yaitu dengan menumbuhkannya dalam rumah kaca intensif terbukti dapat mengurangi kontaminasi eksplan yang diambil dari tanaman induk tersebut, terutama yang disebabkan oleh cendawan. Umur fisiologis dan umur ontogenetic juga sangat berpengaruh terhadap keberhasilan perbanyakan tanaman secara kultur jaringan. Eksplan dari jaringan yang muda secara fisiologis, umumnya lebih baik daripada jaringan tanaman tua. Eksplan dari tanaman juvenile juga mempunyai daya regenerasi yang lebih tinggi daripada eksplan tanaman dewasa.
Masalah yang sering dihadapi pada kultur jaringan yaitu terjadinya percokelatan atau penghitaman bagian eksplan. Pada waktu jaringan tanaman terkena stress mekanik, seperti pelukaan pada waktu proses isolasi eksplan dari tanaman induk atau proses sterilisasi eksplan, metabolisme senyawa berfenol pada eksplan sering bersifat toksik, menghambat pertumbuhan, atau bahkan dapat mematikan jaringan eksplan. Untuk mengatasi hal itu maka perlu pengondisian pada tanaman induk dilingkungan yang bersih (sehat) karena pada tahap ini sangat membantu, karena tidak diperlukan sterilisasiyang terlalu kuat.
Akibat suatu keterbatasan tertentu, eksplan yang digunakan jumlahnya sangat sedikit dan tidak bisa diinisiasi menjadi kultur yang aseptic. Maka yang terpenting adalah eksplan awal harus bisa ditumbuhkan terlebih dahulu, walaupun terkontaminasi oleh bakteri. Setelah itu pucuknya dipotong dengan hati-hati sebagai propagul atau eksplan baru.  Jika kultur berikutnya masih terkontaminasi maka subkultur berikutnya yang dipakai yaitu pucuknya lagi, demekian seterusnya hingga kultur terbebas dari kontaminasi. Namun, penyelamatan kultur sangat tidak dianjurkan jika kultur terkontaminasi oleh cendawan berspora, karena hal ini sangat potensial untuk terjadinya kontaminasi kultur dalam jumlah yang lebih banyak.